Der Verlust von KDM5B lindert pathologische Herzfibrose und Funktionsstörungen durch epigenetische Steigerung der ATF3-Expression

Experimental & Molecular Medicine Band 54, Seiten 2175–2187 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Eine übermäßige Herzfibrose ist von zentraler Bedeutung für unerwünschte Herzumgestaltungen und Funktionsstörungen, die bei vielen Herzerkrankungen zu Herzversagen führen. Die Histonmethylierung spielt bei verschiedenen pathophysiologischen Ereignissen eine entscheidende Rolle. Die Rolle von Histonmethylierungs-Modifikationsenzymen bei pathologischer Herzfibrose muss jedoch noch vollständig geklärt werden. Hier identifizierten wir Lysin-Demethylase 5B (KDM5B), eine Histon-H3K4me2/me3-Demethylase, als einen wichtigen epigenetischen Mediator der pathologischen Herzfibrose. Als Reaktion auf pathologischen Stress wurde die KDM5B-Expression in Herzfibroblasten und Myokardgewebe hochreguliert. Ein KDM5B-Mangel linderte die Herzfibrose deutlich, verbesserte die Herzfunktion und verhinderte eine nachteilige Herzumgestaltung nach einem Myokardinfarkt (MI) oder einer Drucküberlastung. Die Behandlung mit KDM5B-Knockout oder -Inhibitoren schränkte den Übergang von Herzfibroblasten zu profibrogenen Myofibroblasten ein und unterdrückte fibrotische Reaktionen. Ein KDM5B-Mangel erleichterte auch die Umwandlung von Herzfibroblasten in endothelähnliche Zellen und förderte die Angiogenese als Reaktion auf eine Myokardverletzung. Mechanistisch gesehen band KDM5B an den Promotor des aktivierenden Transkriptionsfaktors 3 (Atf3), einem antifibrotischen Regulator der Herzfibrose, und hemmte die ATF3-Expression durch Demethylierung der aktivierten H3K4me2/3-Modifikation, was zu einer verstärkten Aktivierung des TGF-β-Signals und einer übermäßigen Expression von führte profibrotische Gene. Unsere Studie zeigt, dass KDM5B die pathologische Herzfibrose vorantreibt und ein mögliches Ziel für Interventionen bei Herzfunktionsstörungen und Herzinsuffizienz darstellt.

Ischämische und hypertrophe Herzerkrankungen, die beiden häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, die zu Herzinsuffizienz führen, haben das gemeinsame pathologische Merkmal einer nachteiligen Herzumgestaltung. Herzfibrose ist die entscheidende charakteristische Manifestation einer nachteiligen kardialen Umgestaltung, die durch Herzinfarkte hervorgerufen wird und durch Ischämie, hämodynamische Überlastung, neurohumorale Aktivierung und Zytokine hervorgerufen werden kann1. Herzfibrose ist typischerweise durch eine Überaktivierung und übermäßige Proliferation von Myofibroblasten gekennzeichnet, was das Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau extrazellulärer Matrixproteine stört2. Während eine geeignete Fibrose bei der Aufrechterhaltung der Herzstruktur hilfreich ist, um bei manchen Erkrankungen wie einem Myokardinfarkt (MI) eine Herzruptur zu verhindern, führt die überaktivierte fibrotische Reaktion zu einer übermäßigen Ablagerung von Kollagenfasern im lokalisierten oder gesamten Myokard, was zu einer Veränderung der Myokardarchitektur und einer Verringerung der Myokardcompliance führt. Dies führt zur Entwicklung von Herzfunktionsstörungen, Arrhythmien und Herzversagen3,4. Eine große Menge an Literatur zeigt, dass pathologische Herzfibrose einen Hauptweg darstellt, der die klinischen Ergebnisse bei Herzinsuffizienz bei Patienten vermittelt, die ischämischen und nicht-ischämischen Herzstressereignissen ausgesetzt sind5. Ein wirksamer Therapieansatz für Herzfibrose ist jedoch sehr begrenzt, was uns dazu zwingt, die Schlüsselmechanismen, die der pathologischen Herzfibrose zugrunde liegen, weiter zu erforschen.

Unter den zahlreichen Zelltypen im Herzen gelten herzresidente Fibroblasten als die vorherrschende Quelle von Myofibroblasten und machen etwa 11 % der gesamten Zellen im Herzen erwachsener Mäuse aus6,7. Unter normalen physiologischen Bedingungen befinden sich Fibroblasten in einem Ruhezustand. Im verletzten Herzen differenzieren sich Fibroblasten jedoch in aktivierte Myofibroblasten und tragen erheblich zum Umbau des Herzens als Reaktion auf mehrere pathologische Belastungen bei8. Neben der Vermittlung von Herzfibrose können Fibroblasten unter bestimmten Umständen auch das geschädigte Herz umgestalten. Frühere Studien haben beispielsweise gezeigt, dass Fibroblasten einen endothelialen Phänotyp annehmen und die Angiogenese fördern können, um das verletzte Herz zu reparieren9,10. Daher ist die genaue Regulierung des Schicksals von Fibroblasten unter Stressbedingungen von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung der Herzfunktion und die Vorbeugung pathologischer Herzfibrose. Allerdings sind die Mechanismen, die das Schicksal der Fibroblasten steuern und ihren entsprechenden Aktivierungszustand aufrechterhalten, noch nicht vollständig verstanden.

An der Modulation der Herzfibrose sind mehrere Regulierungsmechanismen beteiligt11. Epigenetische Mechanismen, einschließlich der Histonmethylierung, spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Chromatinstruktur und der Genexpression12. Es wurde gezeigt, dass Veränderungen in den Histonmethylierungsprofilen verschiedener Herzzelltypen durch verschiedene pathologische Reize induziert werden können13. Diese Veränderungen können zum Ungleichgewicht der Homöostase in mehreren Zelltypen im Herzen beitragen, einschließlich einer erhöhten Expression von Fibrose-assoziierten Genen in Fibroblasten13. Eine frühere Studie zeigte, dass Histon-Lysin-Methyltransferase DOT1L (Disruptor der Telomer-Stummschaltung 1-like) zur profibrotischen Reaktion in Herzfibroblasten beitrug, indem sie die Aktivierung des Transforming Growth Factor β (TGF-β)/SMAD-Signals verstärkte14, was auf eine Manipulation der Histonmethylierung schließen lässt Profil hat großes Potenzial bei der Überwindung pathologischer Herzfibrose. Es muss jedoch weiter untersucht werden, ob andere Enzyme zur Modifikation der Histonmethylierung eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Zellschicksals und der profibrotischen Reaktionen in Herzfibroblasten spielen.

Lysinspezifische Demethylase 5B (KDM5B), die auch als PLU1 oder Jumonji AT-rich Interactive Domain 1B (JARID1B) bekannt ist, vermittelt die Demethylierung der transkriptionsaktivierten Trimethylierung und Dimethylierung von H3 an Lysin 4 (H3K4me3 und H3K4me2) und unterdrückt die Expression von Zielgenen15. Einige Studien haben gezeigt, dass eine abnormale Expression von KDM5B mit der Entwicklung mehrerer Erkrankungen verbunden ist, einschließlich der Förderung der Tumorentstehung und entzündlicher Erkrankungen16,17. Die Rolle von KDM5B bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist jedoch noch unbekannt. Hier fanden wir heraus, dass der Verlust von KDM5B die Aktivierung von Herzfibroblasten erheblich blockierte und die Angiogenese förderte, indem er den Methylierungsgrad von H3K4me2/3 erhöhte und die Expression des aktivierenden Transkriptionsfaktors 3 (ATF3) in Herzfibroblasten förderte, was pathologische Herzfibrose unterdrückte verhindert Herzfunktionsstörungen. Unsere Studie verdeutlichte die entscheidende epigenetische regulatorische Rolle von KDM5B bei der Pathogenese von aberranter Herzfibrose.

Rekombinantes Maus-TGF-β-Protein (7666-MB) wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) gekauft. Angiotensin II (AngII) (CSN10313) wurde von CSNpharm (Chicago, IL) gekauft. Antikörper gegen α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) (ab5694, für Immunoblot-Analyse), Phospho-SMAD3 (Mitglied der SMAD-Familie 3) (ab52093) und KDM5B (ab181089, für Immunfluoreszenzanalyse) wurden von Abcam (Cambridge, UK) erhalten ). Antikörper gegen Kollagen Typ I (AB765p) wurden von Millipore (Billerica, MA) bezogen. Antikörper gegen α-SMA (5228, für Immunfluoreszenz und Immunhistochemie) wurden von Sigma-Aldrich (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Antikörper gegen Kollagen Typ III (NB600-594) wurden von Novus Biologicals (Littleton, CO) bezogen. Antikörper gegen Phospho-SMAD2 (SMAD-Familienmitglied 2) (3108), SMAD2 (5339), SMAD3 (9523), Phospho-ERK (extrazelluläre signalregulierte MAP-Kinase) (9106), ERK (4696), Phospho-JNK (c -Jun N-terminale Kinase) (4668), JNK (9252), Phospho-p38 (4511), p38 (9212), Phospho-p65 (3033 S), p65 (8242), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (5174) und ATF3 (18665) wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA) erhalten. Antikörper gegen KDM5B (A301-813A, für Immunoblot-Analyse) wurden von Bethyl Laboratories (Montgomery, TX) bezogen.

Wildtyp-C57BL/6-Mäuse wurden von Sipper BK Laboratory Animals (Shanghai, China) erhalten. KDM5B-Knockout (KO)-Mäuse wurden mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems erzeugt. Die 428 Basen, die die JmjC-Domäne enthalten, die für die Demethylaseaktivität verantwortlich ist, wurden aus dem Kdm5b-Gen gelöscht, was zu einer Rasterverschiebung im Kdm5b-Gen und zum Funktionsverlust von KDM5B führte. Alle Mäuse wurden im Versuchstierzentrum der Tongji-Universität unter spezifischen pathogenfreien Barrierebedingungen gehalten und alle Experimente wurden gemäß den vom National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigten Verfahren durchgeführt.

Für AngII-induzierte Drucküberlastung wurde den Mäusen eine osmotische Minipumpe (Alzet-Modell 2004; Alza Corp.), die eine 28-tägige Infusion von Kochsalzlösung oder AngII (1000 ng/kg/min) enthielt, subkutan implantiert. Für das MI-Modell wurde die permanente Ligation der linken vorderen absteigenden Koronararterie wie zuvor beschrieben durchgeführt18. Kurz gesagt, nach der Anästhesierung durch Inhalation von Isofluran (2,5 l/min Isofluran bei 1,5 l/min O2) wurden 8–10 Wochen alte männliche Mäuse mit einem Kleintierbeatmungsgerät mit einem Atemzugvolumen von 0,45 ml zur unterstützten Atmung beatmet. Die Brusthöhle wurde durch eine linke Thorakotomie geöffnet, um das Herz freizulegen, und der linke vordere absteigende Ast wurde dauerhaft mit einer 8–0-Seidenligatur abgebunden. Der Brustkorb und die Haut wurden mit 5–0 bzw. 4–0 Ligaturen verschlossen. Nach dem Entfernen des Trachealtubus wurden die Mäuse auf einer Wärmeunterlage bei 37 °C positioniert, bis das volle Bewusstsein wiederhergestellt war. Am Ende des Versuchsplans nach der AngII-Infusion oder der MI-Operation wurden alle Mäuse nach Anästhesierung mit einer intraperitonealen Überdosis Natriumpentobarbital (70 mg/kg Körpergewicht) durch Zervixluxation eingeschläfert, gefolgt von einer Dissektion des Herzgewebes und relevanten experimentellen Untersuchungen . Zweidimensionale Echokardiographie (Vevo 2100; VisualSonics) mit einer M-Mode- und 30-MHz-Frequenzsonde wurde verwendet, um die Herzfunktion der anästhesierten Mäuse zu vorab festgelegten Zeitpunkten blind zu messen.

Primäre Herzfibroblasten wurden aus dem linksventrikulären Myokard von Mäusen isoliert. Kurz gesagt, die präparierten Herzen von 2 Wochen alten Mäusen wurden mit einer Schere in kleine Stücke von etwa 1 mm3 Größe zerkleinert und dann mit einem vorgewärmten Verdauungspuffer, der 0,125 % Trypsin enthielt, 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Überstände wurden nach mehrmaligem Mischen mit einer Pipette gesammelt und die restlichen Gewebe wurden 4–5 Mal verarbeitet, bis die Verdauung abgeschlossen war. Herzfibroblastenfraktionen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco, MA) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator auf behandelte Gewebekulturschalen (Corning, NY) ausplattiert. Für die Kdm5b-Stummschaltung wurden zwei vorgefertigte Kdm5b-spezifische siRNAs oder Kontroll-siRNAs verwendet, die auf verschiedene Sequenzen verschiedener Unternehmen (Dharmacon, CO; Santa Cruz Biotechnology, TX) abzielen. Anhaftende Herzfibroblasten wurden mit Kdm5b-siRNA oder Kontroll-siRNA unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, MA) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert.

Die Gesamt-RNA wurde aus Myokardgewebe oder kultivierten Herzfibroblasten mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen, CA) extrahiert und mit einem First Strand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO, Shanghai, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers revers transkribiert. Die cDNA jeder Probe wurde verwendet, um Veränderungen in der Expression verschiedener Gene mithilfe von QuantStudio 6 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) zu bewerten. Die Daten wurden auf den Gapdh-Ausdruck normalisiert.

Die Microarray-Analyse wurde mit Agilent Whole Mouse Genome 4 × 44 K-Arrays durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde aus den Proben mit TAKARA RNAiso (TAKARA, Dalian, China) gemäß den Standardarbeitsanweisungen des Herstellers extrahiert. Die Qualität der gesamten RNA wurde durch Elektrophorese des Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA) überprüft und mit einem RNeasy Mini-Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Deutschland) und einem RNase-Free DNase Set (QIAGEN) gereinigt. Markierung, Hybridisierung und Waschen wurden gemäß den Agilent-Richtlinien durchgeführt. Die fertigen hybridisierten Microarrays wurden mit einem Agilent Microarray Scanner (Agilent Technologies, CA) gescannt. Microarray-Signale und Hintergrundinformationen wurden mit der Feature Extraction Software 10.7 (Agilent Technologies) abgerufen und mit der GeneSpring Software 12.6.1 (Agilent Technologies) normalisiert. Die Grenzwerte für den Differentialausdruck wurden als absolute Faltungsänderung >2 und als korrigierter p-Wert <0,05 festgelegt. Transkriptom-Microarray-Daten sind beim Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE197223 verfügbar.

Herzfibroblasten wurden am Tag 7 nach dem Myokardinfarkt aus dem linksventrikulären Myokard von KDM5B-Knockout- oder Wurfgeschwister-WT-Mäusen isoliert. RNA-Proben wurden aus Herzfibroblasten für den Bibliotheksaufbau isoliert und mit einem Illumina NovaSeq 6000 sequenziert, um 150-bp-Paired-End-Reads zu generieren. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von HISAT2 mit Standardparametern auf das Referenzmausgenom (mm10) abgebildet. Die Fragment-pro-Kilobase-Transkript-pro-Million-Mapping-Reads-Werte (FPKM) wurden zur Bewertung der differentiellen Genexpression verwendet. Die Clusterung unterschiedlich exprimierter Gene, die funktionelle Anreicherungsanalyse der Gene Ontology (GO) und andere Datenanalysen wurden mit benutzerdefinierten Programmen durchgeführt. Die RNA-Sequenzierungsdaten sind beim Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE213746 verfügbar.

Platten mit 48 Vertiefungen wurden mit wachstumsfaktorreduzierter Corning-Matrigel-Matrix (Corning Life Sciences, MA) beschichtet und 30 Minuten lang bei 37 °C gemäß dem Protokoll des Herstellers polymerisiert. Gleiche Mengen kultivierter Herzfibroblasten, die aus KDM5B-KO- und Wurfgeschwister-WT-Mäusen isoliert wurden, wurden trypsinisiert und in die beschichteten Platten ausgesät. Nach 4–6 Stunden Inkubation wurde die durch Herzfibroblasten vermittelte Röhrenbildung fotografiert.

Gesamtproteine wurden aus Myokardgewebe oder kultivierten Herzfibroblasten mit Zelllysepuffer (Cell Signaling Technology), der einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Merck, Darmstadt, Deutschland) und Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, extrahiert. Die Konzentrationen der extrahierten Proteine wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Zur Durchführung der Immunoblot-Analyse wurden gleiche Mengen an Proteinen verwendet.

Isolierte Herzen wurden für die histologische Analyse unter Verwendung der zuvor beschriebenen Paraffinschnittmethode vorbereitet19. Kurz gesagt, die geernteten Herzen wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann dehydriert, in Paraffin eingebettet und in eine Reihe von 5 μm dicken Abschnitten geschnitten. Zur Beurteilung des fibrotischen Narbenbereichs wurde eine Masson-Trichrom-Färbung unter Verwendung eines Trichrom-Färbesets gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Immunfluoreszenz- und immunhistochemische Färbungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt10. Digitale Bilder wurden mit einem Leica-Mikroskopsystem (Wetzlar, Deutschland) aufgenommen.

Herzfibroblasten wurden mit 1 % (Vol./Vol.) Formaldehyd vernetzt und die Reaktion wurde mit 0,125 M Glycin beendet. Anschließend wurden Protein-DNA-Komplexe in den geernteten vernetzten Zellen in Eiswasser beschallt, um zufällige Fragmente mit einer Größe zwischen 200 bp und 500 bp zu bilden. Die überstehenden Extrakte wurden durch Zentrifugation gesammelt und dann einer ChIP-Analyse gemäß dem Protokoll des Chromatin Immunoprecipitation Kit (Millipore) unterzogen. Zielgen-Promotorsequenzen in der eingegebenen DNA und den gewonnenen DNA-Immunkomplexen wurden durch Q-PCR nachgewiesen. Die Daten wurden auf die entsprechende DNA-Eingabekontrolle normalisiert. Die zum Nachweis des Atf3-Genpromotors der Maus verwendeten Primer waren wie folgt: 5'-TGACAGGGGCCATTTGAG AAATC-3' (vorwärts) und 5'-CCTCTGAGCAACTCCACAGAGCA-3' (rückwärts).

Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurde durch den ungepaarten Student-t-Test bestimmt. Für Vergleiche von mehr als zwei Gruppen wurde eine ein- oder zweiseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit dem t-Test der geringsten signifikanten Differenz durchgeführt. Die Daten wurden mit Prism 7 (GraphPad) analysiert und p-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Um Enzyme zur Modifikation der Histonmethylierung zu untersuchen, die das Fortschreiten der Herzfibrose nach einer Myokardverletzung modulieren, haben wir zunächst Veränderungen in ihrer Expression im Myokardgewebe nach Myokardinfarkt oder Drucküberlastung gemessen. Unter diesen Enzymen zur Modifikation der Histonmethylierung war der Anstieg der Kdm5b-mRNA-Expression im ischämischen Myokard von Mäusen nach MI am signifikantesten (Abb. 1a). Die KDM5B-Expression im Myokard wurde zeitabhängig hochreguliert und erreichte am Tag 7 nach dem MI ihren Höhepunkt (Abb. 1b, c). Wir beobachteten außerdem Veränderungen in der KDM5B-Expression als Reaktion auf eine Drucküberlastung und stellten fest, dass die Kdm5b-Expression im Myokard nach einer durch AngII-Infusion verursachten Drucküberlastung deutlich erhöht war (Abb. 1d). Anschließend bestimmten wir den Zelltyp, der zum Anstieg der KDM5B-Expression im Myokard nach pathologischem Stress beitrug. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass der Anstieg der KDM5B-Expression vorwiegend auf α-SMA-positive Herzfibroblasten, nicht jedoch auf Kardiomyozyten in Myokardgeweben, die einer MI- oder AngII-Infusion unterzogen wurden, verteilt war (Abb. 1e, f und ergänzende Abb. 1a – d). Darüber hinaus erhöhte die TGF-β-Behandlung die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von KDM5B in primären Herzfibroblasten, die aus dem Myokard der Maus isoliert wurden (ergänzende Abbildung 1e, f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die in Herzfibroblasten erhöhte Histondemethylase KDM5B an pathologischen Prozessen als Reaktion auf verschiedene Arten von Myokardschäden beteiligt ist.

eine Q-PCR-Analyse der mRNA-Expressionsniveaus von Methylierungsmodifikationsenzymen in Myokardgeweben von WT-Mäusen am Tag 7 nach MI oder Scheinoperation (n = 3 für Scheingruppe, n = 4 für MI-Gruppe). b, c Q-PCR-Analyse von Kdm5b-mRNA (n = 6 Mäuse pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der KDM5B-Proteinexpression in Myokardgeweben von WT-Mäusen am angegebenen Tag nach MI oder Scheinoperation. # gibt die Seriennummern der Mäuse an. d Q-PCR-Analyse der Kdm5b-mRNA-Expression in Myokardgeweben von WT-Mäusen am 28. Tag nach der Infusion von AngII oder normaler Kochsalzlösung (NS) (n = 6 Mäuse pro Gruppe). e Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von KDM5B (rot) oder α-SMA (grün) in Myokardgewebe von WT-Mäusen am Tag 7 nach MI oder Scheinoperation. Maßstabsbalken, 50 μm (vergrößert: 10 μm). f Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von KDM5B (rot) oder α-SMA (grün) in Myokardgewebe von WT-Mäusen am Tag 28 nach der AngII- oder NS-Infusion. Maßstabsbalken, 50 μm (vergrößert: 10 μm). *p < 0,05, ***p < 0,001. Es wurde ein ungepaarter Student-t-Test (a, d) oder eine einfaktorielle ANOVA (b) durchgeführt.

KDM5B-defiziente Mäuse auf einem C57BL/6-Hintergrund wurden mit dem CRISPR/Cas9-System erzeugt, das eine 428-bp-Deletion in der Jmjc-Domäne vermittelte, die für ihre Demethylaseaktivität und die begleitende Frameshift-Mutation im Kdm5b-Gen verantwortlich ist (ergänzende Abbildung 2a). ). In Herzfibroblasten von KDM5B-KO-Mäusen gab es nahezu keine mRNA- oder Proteinexpression von KDM5B (ergänzende Abbildung 2b, c). Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung keine Expression von KDM5B in den Kernen von KDM5B-defizienten Herzfibroblasten (ergänzende Abbildung 2d). Die Echokardiographieanalyse ergab keinen Unterschied in der Herzfunktion zwischen KDM5B-KO- und Kontroll-Wurfgeschwister-WT-Mäusen unter physiologischen Bedingungen (ergänzende Abbildung 2e, f). Massons Trichrom-Färbung deutete darauf hin, dass Mäuse mit KDM5B-Mangel im Vergleich zu WT-Mäusen unter physiologischen Bedingungen keine nachteilige Herzumgestaltung zeigten (ergänzende Abbildung 2g). Als nächstes untersuchten wir die Rolle von KDM5B bei der Herzfunktion und dem Umbau nach einem MI. KDM5B-KO-Mäuse zeigten an den Tagen 14–28 nach dem Myokardinfarkt im Vergleich zu Kontroll-Wurfgeschwister-WT-Mäusen erhöhte Prozentsätze der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF) und der linksventrikulären fraktionierten Verkürzung (LVFS) (Abb. 2a). Bei KDM5B-KO-Mäusen nach MI wurden auch verringerte linksventrikuläre Abmessungen und linksventrikuläre Volumina beobachtet (Abb. 2a und ergänzende Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass ein KDM5B-Mangel die Kontraktilfunktion verbesserte und die linksventrikuläre Dilatation des Herzens nach MI verringerte. Ein KDM5B-Mangel verringerte das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht (HW/BW) und Herzgewicht zu Tibialänge (HW/TL) (ergänzende Abbildung 3b, c). Massons Trichrom- und Sirius-Rot-Färbung zeigten deutlich verringerte Narben- und Fibrosebereiche im Myokard von KDM5B-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen nach MI (Abb. 2b – e). Die mRNA-Expressionsniveaus von Fibrose-bezogenen Genen, einschließlich Kollagen Typ I Alpha 1-Kette (Col1a1), Kollagen Typ III Alpha 1 Kette (Col3a1), Fibronektin 1 (Fn1), zellulärer Kommunikationsnetzwerkfaktor 2 (Ccn2), Tgfb und Aktin Die glatten Alpha-2-Muskeln (Acta2) im Myokard wurden durch KDM5B-Mangel dramatisch unterdrückt (Abb. 2f und ergänzende Abb. 3d). Immunfluoreszenz und immunhistochemische Färbung zeigten eine begrenzte Anzahl von α-SMA-positiven Myofibroblasten im Myokard und eine verringerte Expression von Kollagen III in den Myofibroblasten von KDM5B-KO-Mäusen (Abb. 2g und ergänzende Abb. 3e, f). Diese Daten deuten darauf hin, dass KDM5B die durch überaktivierte Myofibroblasten vermittelte Herzfibrose verschlimmert, was zu einer schlimmeren Herzfunktionsstörung und einem ungünstigen Umbau des Herzens nach einem Myokardinfarkt führt.

a Echokardiographische Messung von LVEF, LVFS, linksventrikulärer enddiastolischer Innendimension (LVIDd) und linksventrikulärer enddiastolischer Innendimension (LVIDs) von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen zu Studienbeginn (Tag 0) und am angegebenen Tag danach MI oder Scheinoperation (n = 6 Mäuse pro Gruppe). b–e Repräsentative Masson-Trichrom-Färbungsbilder und Quantifizierung der Narbengröße (b, c) oder Sirius-Rot-Färbungsbilder und Quantifizierung des Fibrosebereichs (d, e) in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach MI . n = 6 Mäuse pro Gruppe. Maßstabsbalken, 1,6 mm (oben), 200 μm (unten). f Q-PCR-Analyse der Col1a1- und Col3a1-mRNA-Spiegel in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 14 nach MI oder Scheinoperation (n = 6 Mäuse pro Gruppe). g Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von α-SMA (rot) und Col III (grün) in Myokardgewebe von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 14 nach MI (n = 6 Mäuse pro Gruppe). Maßstabsbalken, 50 μm. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Es wurde ein ungepaarter Student-t-Test (c, e) oder eine ANOVA (a, f) durchgeführt.

Wir untersuchten weiter die Rolle von KDM5B bei der Herzfunktion und Fibrose nach Drucküberlastung. Ein KDM5B-Mangel verbesserte die Herzfunktion nach einer durch AngII-Infusion verursachten Drucküberlastung signifikant (Abb. 3a–c). KDM5B-defiziente Mäuse zeigten ein verringertes Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht und Schienbeinlänge (Abb. 3d, e). Massons Trichrom-Färbung zeigte, dass die perivaskuläre und interstitielle Myokardfibrose bei Mäusen mit KDM5B-Mangel im Vergleich zu WT-Mäusen, die einer AngII-Infusion unterzogen wurden, dramatisch abgeschwächt war (Abb. 3f – i). Die mRNA-Spiegel von Fibrose-bezogenen Genen, einschließlich Acta2, Col1a1, Col3a1 und Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf), waren im Myokardgewebe von Mäusen mit KDM5B-Mangel nach der AngII-Infusion deutlich verringert (Abb. 3j). Ein KDM5B-Mangel hemmte die Proteinexpression von Kollagen I und Kollagen III im Myokardgewebe nach der AngII-Infusion (Abb. 3k). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine verringerte Kollagen-III-Produktion in den begrenzten α-SMA-positiven Myofibroblasten im Myokard von Mäusen mit KDM5B-Mangel nach AngII-Infusion (Abb. 3l und ergänzende Abb. 3g). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein KDM5B-Mangel vor Herzfunktionsstörungen, Herzfibrose und durch Drucküberlastung ausgelösten pathologischen Umbauten schützt.

a Repräsentative echokardiographische M-Modus-Bilder der linken Ventrikel von KDM5B-KO- oder Wurfgeschwister-Kontroll-WT-Mäusen am 28. Tag nach der Infusion von AngII oder normaler Kochsalzlösung (NS). b, c Echokardiographische Messung der LVEF (b) und LVFS (c) von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach der AngII- oder NS-Infusion (n = 6 Mäuse pro Gruppe). d, e Das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht (HW/BW) (d) und das Verhältnis von Herzgewicht zu Tibialänge (HW/TL) (e) von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach AngII oder NS Infusion (n = 6 Mäuse pro Gruppe). f–i Repräsentative Masson-Trichrombilder und Quantifizierung der perivaskulären (f, g) oder interstitiellen (h, i) Fibrose in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach der AngII- oder NS-Infusion (n = 6 Mäuse pro Gruppe) . Maßstabsbalken, 200 μm (links), 100 μm (rechts). j Q-PCR-Analyse der mRNA-Expressionsniveaus von Acta2, Col1a1, Col3a1 und Ctgf in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach der AngII- oder NS-Infusion (n = 6 Mäuse pro Gruppe). k Immunblot-Analyse der Col I- und Col III-Proteinexpression in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach der AngII- oder NS-Infusion. l Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von α-SMA (rot) und Col III (grün) in Myokardgewebe von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 28 nach der AngII-Infusion. Maßstabsbalken, 50 μm. *p < 0,05, **p < 0,01. Es wurde ein ungepaarter Student-t-Test (g, i) oder eine einfaktorielle ANOVA (b–e, j) durchgeführt.

Anschließend untersuchten wir die Wirkung von KDM5B auf fibrotische Reaktionen in Fibroblasten. Eine RNA-seq-Analyse wurde durchgeführt, um die Transkriptom-Profilierungsmerkmale primärer Herzfibroblasten zu identifizieren, die aus dem Myokardgewebe von KDM5B-KO- und WT-Mäusen nach MI isoliert wurden. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) deutete darauf hin, dass KDM5B-KO-Mäuse eine verminderte Expression von Genen zeigten, die mit der Organisation von Kollagenfibrillen und der Organisation der extrazellulären Matrix zusammenhängen, was zwei vorherrschende Kennzeichen für nachteilige Herzumgestaltung und Herzfibrose sind (ergänzende Abbildung 4a – d). Aus dem Myokardgewebe von KDM5B-KO- und WT-Mäusen isolierte primäre Herzfibroblasten wurden in vitro mit dem profibrotischen Faktor TGF-β behandelt. Die mRNA-Expressionsniveaus von Fibrose-bezogenen Genen, einschließlich Col1a1, Col3a1, Fn1 und Ccn2, waren in KDM5B-defizienten Herzfibroblasten als Reaktion auf TGF-β deutlich verringert (Abb. 4a). Konsistent wurden in KDM5B-defizienten Herzfibroblasten nach TGF-β-Stimulation unterdrückte Proteinexpressionsniveaus von Kollagen I und Kollagen III beobachtet (Abb. 4b). Ähnliche Abnahmen der Expressionsniveaus dieser mit Fibrose in Zusammenhang stehenden Moleküle wurden bei Herzfibroblasten mit Kdm5b-Knockdown beobachtet, der durch zwei Arten spezifischer siRNAs als Reaktion auf TGF-β vermittelt wurde (Abb. 4c, d und ergänzende Abb. 5a – c). GSK467 wurde als wirksamer und selektiver Inhibitor von KDM5B20 identifiziert. Nach der Behandlung mit GSK467 wurden die mRNA-Spiegel von Col1a1, Col3a1, Fn1 und Ccn2 sowie die durch TGF-β in Herzfibroblasten induzierten Proteinspiegel von Kollagen I und Kollagen III signifikant gehemmt (Abb. 4e, f). Die Umwandlung von Fibroblasten in Myofibroblasten mit profibrotischem Phänotyp ist durch eine erhöhte Expression von α-SMA und morphologische Veränderungen bei der Bildung zahlreicher Aktin-Mikrofilamentbündel gekennzeichnet21. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine deutlich eingeschränkte Produktion von α-SMA und eine erhaltene Fibroblastenmorphologie bei KDM5B-defizienten Herzfibroblasten und Wildtyp-Fibroblasten mit Kdm5b-Knockdown oder GSK467-Behandlung nach TGF-β-Stimulation (Abb. 4g – i und ergänzende Abb. 5d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KDM5B die Bildung von Myofibroblasten-Phänotypen und das durch Herzfibroblasten vermittelte Fortschreiten der Fibrose erleichtert.

a, b Q-PCR-Analyse der Col1a1-, Col3a1-, Fn1- und Ccn2-mRNA-Expression (a) (n = 6 pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der Col I- und Col III-Proteinexpression (b) bei KDM5B-defizienten (KO) oder Wurfgeschwistern Kontroll-WT-Herzfibroblasten, stimuliert mit TGF-β (10 ng/ml) für 24 Stunden. c, d Q-PCR-Analyse der Col1a1-, Col3a1-, Fn1- und Ccn2-mRNA-Expression (c) (n = 6 pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der Col I- und Col III-Proteinexpression (d) in Kdm5b-stummgeschalteter oder Kontroll-siRNA-transfizierter Herzfibroblasten, 24 Stunden lang mit TGF-β (10 ng/ml) stimuliert. e, f Q-PCR-Analyse der Col1a1-, Col3a1-, Fn1- und Ccn2-mRNA-Expression (e) (n = 6 pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der Col I- und Col III-Proteinexpression (f) in Herzfibroblasten, die mit dem KDM5B-Inhibitor GSK467 behandelt wurden oder DMSO, gefolgt von einer 24-stündigen Stimulation mit TGF-β (10 ng/ml). g–i Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von α-SMA (rot) in Herzfibroblasten mit KDM5B-Mangel (g), KDM5B-Knockdown (h) oder GSK467-Behandlung (i) und den entsprechenden Kontroll-Herzfibroblasten (g–i), stimuliert mit TGF- β (10 ng/ml) für 24 Stunden. Ähnliche Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Experimenten (g–i) erhalten. Maßstabsbalken, 50 μm. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Es wurde der ungepaarte Student-t-Test (a, c, e) durchgeführt.

Die Aktivierung des SMAD-abhängigen oder SMAD-unabhängigen TGF-β-Signalwegs ist ein wesentlicher Faktor für die Entstehung von Fibrose. Die Unterdrückung der SMAD2- und SMAD3-Phosphorylierung deutete auf eine Abnahme der Aktivierung des SMAD-abhängigen TGF-β-Signals im Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen nach MI hin (Abb. 5a). Die Aktivierung der SMAD-unabhängigen TGF-β-Signalübertragung, einschließlich der Phosphorylierung von ERK, JNK, p38 und p65, war im Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen nach MI beeinträchtigt (Abb. 5b). Konsistent wurde in den Myokardgeweben von KDM5B-KO-Mäusen nach der AngII-Infusion eine unterdrückte Aktivierung der SMAD-abhängigen oder SMAD-unabhängigen TGF-β-Signalisierung beobachtet, was durch eine verminderte Phosphorylierung von SMAD2, SMAD3, ERK, JNK, p38 und p65 angezeigt wird ( Abb. 5c, d). Darüber hinaus unterdrückte ein KDM5B-Mangel oder -Knockdown die durch TGF-β induzierte Aktivierung von SMAD2, SMAD3, ERK, JNK, p38 und p65 in primären Herzfibroblasten deutlich (Abb. 5e – f und ergänzende Abb. 6a, b). Diese Daten deuten darauf hin, dass KDM5B fibrotische Reaktionen und den Übergang von Herzfibroblasten erleichtert, indem es die SMAD-abhängige oder SMAD-unabhängige TGF-β-Signalaktivierung unter pathologischen Bedingungen verstärkt.

eine Immunblot-Analyse der phosphorylierten (p-) oder Gesamtkonzentrationen der SMAD2- und SMAD3-Proteine in den Lysaten von Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder Wurfgeschwister-Kontroll-WT-Mäusen nach MI oder Scheinoperation. b Immunoblot-Analyse der phosphorylierten oder Gesamtspiegel der Proteine ERK, JNK, p38 und p65 in den Lysaten von Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen nach MI oder Scheinoperation. c Immunblot-Analyse der phosphorylierten oder Gesamtspiegel der SMAD2- und SMAD3-Proteine in den Lysaten von Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen nach AngII- oder normaler Kochsalzlösung (NS)-Infusion. d Immunoblot-Analyse der phosphorylierten oder Gesamtspiegel der Proteine ERK, JNK, p38 und p65 in den Lysaten von Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen nach Infusion von AngII oder normaler Kochsalzlösung (NS). e Immunoblot-Analyse der phosphorylierten oder Gesamtkonzentrationen der SMAD2- und SMAD3-Proteine in den Lysaten von Herzfibroblasten von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen, die für die angegebenen Zeiten mit TGF-β (10 ng/ml) behandelt wurden. f Immunoblot-Analyse der phosphorylierten oder Gesamtkonzentrationen der Proteine ERK, JNK, p38 und p65 in den Lysaten von Herzfibroblasten von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen, die für die angegebenen Zeiten mit TGF-β (10 ng/ml) behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Angiogenese Herzfunktionsstörungen und nachteilige Herzumgestaltung nach MI und AngII-induzierter Drucküberlastung lindert22,23. Die Microarray-Analyse von RNA aus dem Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen und Kontroll-Wurfgeschwister-WT-Mäusen nach MI deutete auf angereicherte, differenziell exprimierte Gene hin, die mit der Angiogenese zusammenhängen (ergänzende Abbildung 7a). Darüber hinaus wurde im Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen nach MI eine erhöhte Expression positiv regulierter Angiogenese-assoziierter Gene und eine verringerte Expression negativ regulierter Angiogenese-assoziierter Gene beobachtet (ergänzende Abbildung 7b). Ein KDM5B-Mangel erhöhte die Expressionsniveaus von Endothelmarkergenen, einschließlich des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (Vegfa), Cd31, des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (Vegfr2), der Stickoxidsynthase 3 (Nos3) und des von Willebrand-Faktors (Vwf), im Myokard Gewebe nach MI (Abb. 6a). Es wurde berichtet, dass die durch den Übergang von Fibroblasten zu Endothelzellen vermittelte Angiogenese die Herzreparatur nach einer Myokardverletzung erleichtert9. In Übereinstimmung mit der Microarray-Analyse zeigte eine weitere RNA-seq-Analyse von Fibroblasten, die aus den Myokardgeweben von KDM5B-KO- und WT-Mäusen isoliert wurden, die Anreicherung unterschiedlich exprimierter Gene im Zusammenhang mit der Angiogenese nach MI (Abb. 6b). GSEA zeigte in Herzfibroblasten von KDM5B-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen nach MI einen signifikant hochregulierten Gensatz, der mit dem weithin bekannten proangiogenen VEGF-Signalweg angereichert ist (Abb. 6c). Darüber hinaus waren die am häufigsten identifizierten differentiell exprimierten Gene die erhöhte Expression positiv regulierter Angiogenese-bezogener Gene und die verringerte Expression negativ regulierter Angiogenese-bezogener Gene in Herzfibroblasten von KDM5B-KO-Mäusen nach MI (Abb. 6d). Darüber hinaus wurden am Tag 7 nach dem Myokardinfarkt Kardiomyozyten und Herzfibroblasten aus den Myokardgeweben von KDM5B-KO- und WT-Mäusen zum Nachweis von Genveränderungen isoliert. Wie in der ergänzenden Abbildung 7c gezeigt, beeinflusste der KDM5B-Mangel die angiogenesebedingte Genexpression in Kardiomyozyten nicht, erhöhte jedoch deren Expressionsniveau in Herzfibroblasten. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine erhöhte Expression von VEGFR oder IB4, kolokalisiert mit Vimentin-positiven Herzfibroblasten, im Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen nach MI (Abb. 6e, f und ergänzende Abb. 7d, e). Ein KDM5B-Mangel erhöhte die Expressionsniveaus von Endothelmarkergenen, einschließlich Vegfa, Cd31, Vegfr2, Nos3 und Vwf, in primären Herzfibroblasten, die aus dem Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen isoliert wurden (Abb. 6g). Ein KDM5B-Mangel verstärkte die durch primäre Herzfibroblasten vermittelte Röhrenbildung (ergänzende Abbildung 7f). Diese Daten deuten darauf hin, dass der Verlust von KDM5B den Übergang von Fibroblasten zu endothelähnlichen Zellen erleichtert und die Angiogenese verstärkt, wodurch Herzfibrose und Funktionsstörungen als Reaktion auf pathologische Verletzungen abgeschwächt werden.

eine Q-PCR-Analyse der Vegfa-, Cd31-, Vegfr2-, Nos3- und Vwf-mRNA-Spiegel in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 7 nach der MI-Operation (n = 6 Mäuse pro Gruppe). b Genontologie-Anreicherungsanalyse, die die 15 am häufigsten differenziell exprimierten Gene in primären Herzfibroblasten zeigt, die aus dem Herzgewebe von KDM5B-KO- und Wurfgeschwister-Kontroll-WT-Mäusen am Tag 7 nach der MI-Operation isoliert wurden (biologischer BP-Prozess, zelluläre CC-Komponente, molekulare MF-Funktion). c GSEA-Anreicherungsdiagramm, das Gensätze zeigt, die mit dem VEGF-Signalweg in primären Herzfibroblasten assoziiert sind, wie in b. d Heatmap, die unterschiedlich exprimierte Gene im Verhältnis zur positiven und negativen Regulation der Angiogenese in primären Herzfibroblasten zeigt, wie in b. e, f Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von VEGFR (grün) (e), IB4 (grün) (f) und Vimentin (rot) (e, f) in Myokardgewebe von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 7 nach der MI-Operation. Maßstabsbalken, 50 μm. Ähnliche Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten. g Q-PCR-Analyse der Vegfa-, Cd31-, Vegfr2-, Nos3- und Vwf-mRNA-Expression in KDM5B-defizienten (KO) oder WT-Herzfibroblasten, die 24 Stunden lang mit TGF-β (10 ng/ml) stimuliert wurden (n = 4 pro Gruppe). *p < 0,05, **p < 0,01. Es wurde der ungepaarte Student-t-Test (a, g) durchgeführt.

Wir untersuchten weiter den Mechanismus, der der durch KDM5B-Mangel vermittelten abgeschwächten Herzfibrose und Funktionsstörung zugrunde liegt. Unter den am häufigsten hochregulierten exprimierten Genen, die aus RNAs von Myokardgeweben in KDM5B-KO-Mäusen und Kontroll-Wurfgeschwister-WT-Mäusen nach MI gescreent wurden, erregte die deutlich erhöhte Expression von Atf3 in Myokardgeweben von KDM5B-KO-Mäusen unsere Aufmerksamkeit (Abb. 7a). Konsistent zeigte die RNA-seq-Analyse eine erhöhte Expression von Atf3 in KDM5B-defizienten Herzfibroblasten (ergänzende Abbildung 8a). Frühere Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte ATF3-Expression in Herzfibroblasten unerwünschte Herzumgestaltungen verhindern und durch ischämische oder hypertrophe Verletzungen verursachte Myokardfibrose unterdrücken kann24,25. Die Atf3-Expression im Myokardgewebe von Wildtyp-Mäusen erreichte am ersten Tag nach dem MI ihren Höhepunkt und sank dann an den Tagen 3 bis 7 auf ein relativ höheres Niveau (Abb. 7b). Ein KDM5B-Mangel erhöhte die mRNA- und Proteinexpression von ATF3 im Myokardgewebe nach einem MI (Abb. 7c, d). Die mRNA- und Proteinspiegel von ATF3 in mit TGF-β stimulierten primären Herzfibroblasten wurden durch Kdm5b-Knockdown oder GSK467-Inhibitor-Behandlung hochreguliert (Abb. 7e – h und ergänzende Abb. 8b, c). Die durch TGF-β induzierten Expressionsniveaus von Fibrose-bezogenen Genen wie Col1a1, Col3a1, Fn1 und Ccn2 in primären Herzfibroblasten waren nach Kdm5b-Knockdown signifikant verringert oder nach Atf3-Knockdown allein erhöht, während die durch vermittelte verringerte Expression dieser fibrotischen Gene verringert wurde Der Kdm5b-Knockdown könnte durch den Knockdown von Atf3 rückgängig gemacht werden (Abb. 7i, j). Diese Daten deuten darauf hin, dass ATF3 ein nachgeschaltetes Ziel von KDM5B ist und dass ein KDM5B-Mangel die Herzfibrose durch eine Erhöhung der ATF3-Expression abschwächt.

Eine Heatmap, die die 20 am häufigsten hochregulierten, differenziell exprimierten Gene in Myokardgeweben von KDM5B-KO- und Wurfgeschwister-Kontroll-WT-Mäusen am Tag 7 nach der MI-Operation zeigt. b Q-PCR-Analyse der Atf3- und Kdm5b-mRNA-Expression im Myokardgewebe von WT-Mäusen am angegebenen Tag nach MI oder Scheinoperation (n = 6 pro Gruppe). #p < 0,05 vs. Kdm5b-mRNA-Spiegel in der Scheinoperationsgruppe; *p < 0,05, **p < 0,01 vs. Atf3-mRNA-Spiegel in der Scheinoperationsgruppe. c, d Q-PCR-Analyse von Atf3-mRNA (c) (n = 6 Mäuse pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der ATF3-Proteinspiegel (d) in Myokardgeweben von KDM5B-KO- oder WT-Mäusen am Tag 7 nach der MI-Operation. e, f Q-PCR-Analyse der Atf3-mRNA-Expression (e) (n = 6 pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der ATF3-Proteinexpression (f) in Kdm5b-stummgeschalteten oder Kontroll-siRNA-transfizierten Herzfibroblasten, die mit TGF-β (10 ng) stimuliert wurden /ml) für 24 Stunden. g, h Q-PCR-Analyse der Atf3-mRNA-Expression (g) (n = 6 pro Gruppe) oder Immunoblot-Analyse der ATF3-Proteinexpression (h) in Herzfibroblasten, die mit dem KDM5B-Inhibitor GSK467 oder DMSO behandelt wurden, gefolgt von einer Stimulation mit TGF-β ( 10 ng/ml) für 24 Stunden. i Immunoblot-Analyse der ATF3-Proteinexpression in Herzfibroblasten, die mit Atf3-siRNA oder Kontroll-siRNA transfiziert wurden. j Q-PCR-Analyse der mRNA-Expressionsniveaus von Col1a1, Col3a1, Fn1 und Ccn2 in Herzfibroblasten, die mit Kdm5b-siRNA, Atf3-siRNA, Kontroll-siRNA transfiziert oder mit Kdm5b- und Atf3-siRNA cotransfiziert wurden, gefolgt von einer Stimulation mit TGF-β (10 ng/ml) für 24 h (n = 6 pro Gruppe). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Es wurden ein ungepaarter Student-t-Test (c, e, g) und eine ANOVA (b, j) durchgeführt.

Da es sich bei KDM5B um eine Histon-H3K4me3- und H3K4me2-Demethylase15 handelt, untersuchten wir als Nächstes, ob KDM5B die ATF3-Expression reguliert, indem es den Methylierungsgrad des Histons H3K4 beeinflusst. Die Rekrutierung von KDM5B für den Atf3-Promotor war in Herzfibroblasten nach TGF-β-Stimulation deutlich verstärkt (Abb. 8a). In Herzfibroblasten, die aus dem Myokardgewebe von KDM5B-KO-Mäusen isoliert wurden, wurden deutlich erhöhte H3K4me2- und H3K4me3-Spiegel beobachtet (Abb. 8b). Konsistent erhöhte Kdm5b-Knockdown oder GSK467-Behandlung die Spiegel von H3K4me2 und H3K4me3 in Wildtyp-Herzfibroblasten, die mit TGF-β stimuliert wurden (Abb. 8c, d). In Wildtyp-Herzfibroblasten wurden nach 24-stündiger Stimulation mit TGF-β verringerte H3K4me2- und H3K4me3-Spiegel am Promotor des Atf3-Gens gefunden (Abb. 8e, f). Im Gegensatz dazu erhöhte ein KDM5B-Mangel die Spiegel von H3K4me2 und H3K4me3 am Promotor des Atf3-Gens in Herzfibroblasten als Reaktion auf die TGF-β-Behandlung deutlich (Abb. 8g, h). Diese Ergebnisse zeigen, dass KDM5B direkt an den Atf3-Promotor bindet und die ATF3-Transkription über seine Histon-Demethylase-Aktivität hemmt, was wiederum die Herzfibrose und den nachteiligen Umbau des Herzens nach MI und Drucküberlastung verschlimmert (ergänzende Abbildung 9).

eine ChIP-Analyse der KDM5B-Anreicherungsniveaus am Atf3-Promotor in WT-Herzfibroblasten, die 24 Stunden lang mit TGF-β (10 ng/ml) oder dem Kontroll-PBS (Ctrl) behandelt wurden. n = 6 pro Gruppe. b–d Immunblot-Analyse der H3K4me2- und H3K4me3-Spiegel in Herzfibroblasten mit KDM5B-Mangel (b), KDM5B-Knockdown (c) oder GSK467-Behandlung (d) und den entsprechenden Kontroll-Herzfibroblasten (b–d), stimuliert mit TGF-β (10 ng). /ml) für die angegebenen Zeiten. Ähnliche Ergebnisse wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten. e, f ChIP-Analyse der H3K4me2- (e) oder H3K4me3- (f) Spiegel am Atf3-Promotor von WT-Herzfibroblasten, die 24 Stunden lang mit TGF-β (10 ng/ml) oder Kontroll-PBS (Ctrl) behandelt wurden. n = 6 pro Gruppe. g, h ChIP-Analyse der H3K4me2- (g) oder H3K4me3- (h) Spiegel am Atf3-Promotor von KDM5B-defizienten (KO) oder WT-Herzfibroblasten, die 24 Stunden lang mit TGF-β (10 ng/ml) stimuliert wurden. n = 6 pro Gruppe. *p < 0,05, ***p < 0,001. Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA (a, e–h) durchgeführt.

Herzfibrose, das häufigste pathologische Merkmal vieler Herzerkrankungen, ist mit einer schlechten Prognose verbunden, beispielsweise einer Herzinsuffizienz. In dieser Studie haben wir die neuartige Rolle der Histondemethylase KDM5B bei der Erleichterung der Pathogenese der Herzfibrose aufgezeigt. KDM5B vermittelte die Demethylierung von aktiviertem H3K4me2/3 am Atf3-Promotor und unterdrückte die Atf3-Expression, was zu einer übermäßigen Herzfibrose und einer Verschlechterung der Herzfunktion nach einem ischämischen und hypertrophen Anfall führte.

Die fehlerhafte Expression mehrerer pathogener Gene ist eng mit der Entstehung und dem Fortschreiten von Herzerkrankungen verbunden. Die unterschiedlichen epigenetischen Modifikationen und Standorte von Histonen spielen eine entscheidende und präzise Rolle bei der Regulierung der Transkription dieser pathogenen Gene26. Unter den verschiedenen Arten von Histonmodifikationen hat das durch Histonmethyltransferasen und -demethylasen vermittelte reversible Methylierungsmodifikationsprofil wichtige Funktionen bei mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen27. Eine frühere Studie zeigte, dass G9a, eine Methyltransferase, die die Mono-/Dimethylierung von H3K9 vermittelt, einen Komplex mit dem Myozyten-Enhancer-Faktor 2C (MEF2C) bildet und Heterochromatin bindet, um Herzfibrose zu unterdrücken28. Die Stummschaltung der endothelspezifischen Histon-Methyltransferase-SET-Domäne, die 1 (SET1) enthält, könnte Herzfibrose und Hypertrophie hemmen, indem die Endothelin-1-Transkription als Reaktion auf eine chronische AngII-Behandlung unterdrückt wird29. Es gibt jedoch nur begrenzte Studien zur Rolle von Histon-Demethylasen bei pathologischer Herzfibrose. Der Myocardin-assoziierte Transkriptionsfaktor A (MRTF-A) fördert den Makrophagenhandel durch Wechselwirkung mit Lysin-Demethylase 3 A (KDM3A) und verschlimmert Herzfibrose und -hypertrophie. Ob KDM3A jedoch in Abhängigkeit von der Demethylaseaktivität funktioniert, bleibt unklar30. Für die wichtige Histon-H3K4me2/3-Demethylase KDM5B konzentrierten sich frühere Studien zu ihrer Funktion auf onkologische und infektiöse Erkrankungen. Beispielsweise unterdrückte KDM5B die Antitumorimmunität und vermittelte die Immunumgehung bei Melanomen, indem es SETDB1 (SET domain bifurcated histon lysine methyltransferase 1) rekrutierte, um Retroelemente zum Schweigen zu bringen31. Ein KDM5B-Mangel förderte die Produktion von Entzündungszytokinen erheblich und erleichterte angeborene Entzündungsreaktionen, die durch verschiedene Krankheitserreger ausgelöst wurden17,32. Unsere Studie liefert Hinweise darauf, dass KDM5B das Fortschreiten der pathologischen Herzfibrose vorantreibt, indem es die Demethylierung von aktiviertem H3K4me2/3 am Atf3-Promotor vermittelt und dessen Expression hemmt. Somit identifizieren unsere Ergebnisse KDM5B als eine neuartige profibrotische Histon-Demethylase und offenbaren einen neuen epigenetischen Regulierungsansatz für Herzfibrose unter pathologischen Stressbedingungen.

Die Haupterscheinungen der Herzfibrose sind die übermäßige Umwandlung von Fibroblasten in Myofibroblasten, begleitet von einer übermäßigen Synthese und einem unzureichenden Abbau der extrazellulären Matrix, was zu einer verminderten Myokardcompliance, einer diastolisch-systolischen Dysfunktion und sogar dem Auftreten einer Herzinsuffizienz führt2. Pathologische Herzfibrose hängt von der Transkriptionsregulation mehrerer fibrotischer Signalwege ab, von denen Transkriptionsfaktoren eine wichtige regulatorische Rolle bei der Aktivierung von Signalkomponenten spielen33. In dieser Studie stellten wir fest, dass die ATF3-Expression im Myokard von KDM5B-defizienten Mäusen unter pathologischen Bedingungen deutlich erhöht war. Wir haben außerdem gezeigt, dass ein KDM5B-Mangel die ATF3-Expression fördert, indem er den Grad der aktivierten H3K4me2/3-Methylierung in seiner Promotorregion erhöht. Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Transkriptionsfaktor ATF3 ein wesentliches Downstream-Ziel von KDM5B bei Herzfibrose ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass ATF3 bei der Fibrose in verschiedenen Organen eine doppelte Rolle spielt. Es häufen sich Belege dafür, dass ATF3 das Fortschreiten der Herzfibrose begrenzt und nachteilige Herzumgestaltungen verhindert, die durch ischämische oder hypertrophe Verletzungen ausgelöst werden24,25,34. Allerdings wurde eine Überexpression von ATF3 in fibrotischen Lebern festgestellt und trug durch die Aktivierung hepatischer Sternzellen zur Leberfibrose bei35. Darüber hinaus spielt ATF3 eine profibrotische Rolle bei systemischer Sklerose und Bleomycin-induzierten Lungenschäden36,37. Die funktionellen Unterschiede von ATF3 bei Organfibrose können mit unterschiedlichen Zelltypen und profibrotischen Mechanismen zusammenhängen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten über das Herz bestätigen unsere Daten, dass ATF3, ein Schlüsselregulator, der durch KDM5B epigenetisch unterdrückt wird, die durch Herzfibroblasten vermittelte Myokardfibrose als Reaktion auf ischämischen oder hypertrophen Stress hemmen kann.

Aufgrund der extrem geringen Regenerationsfähigkeit von Kardiomyozyten ist der Wiederaufbau und die Wiederherstellung des Blutflussnetzwerks im Infarktbereich für die Reparatur nach einer Myokardverletzung bei ischämischen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Die kardiale Angiogenese ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Herzfunktion und die Anpassung des Myokards an Drucküberlastung23,38. Endothelzellen gelten als die wichtigsten Zellen, die die Angiogenese vermitteln, doch der Beitrag von Fibroblasten sollte nicht vernachlässigt werden. Fibroblasten können durch parakrine Sekretion die durch Endothelzellen vermittelte Angiogenese fördern und sich in Endothelzellen umwandeln, wodurch die Angiogenese nach einer Herzverletzung vermittelt wird9,39,40,41. Unsere Studie liefert Hinweise darauf, dass ein KDM5B-Mangel die Expression von Angiogenese-assoziierten Genen erhöht und die Transdifferenzierung von Fibroblasten zu endothelähnlichen Zellen fördert, was die Angiogenese fördert und zur Linderung von Herzfunktionsstörungen unter pathologischen Bedingungen beiträgt. Der zugrunde liegende Mechanismus der durch KDM5B-Mangel vermittelten verstärkten Angiogenese könnte die Regulierung der Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren wie Nodal beinhalten, was weiter untersucht werden muss.

Epigenetische Therapien haben sich zu neuen und wertvollen Forschungsbereichen in der Arzneimittelentwicklung entwickelt. Die Verfügbarkeit verschiedener Regulatoren epigenetischer Modifikationsenzyme in klinischen Studien konzentrierte sich hauptsächlich auf onkologische Erkrankungen. Beispielsweise zeigten der selektive Inhibitor der Histon-Methyltransferase EZH2 (Verstärker der Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2-Untereinheit) oder der Histon-Demethylase LSD1 (Lysin-spezifische Demethylase 1) eine vielversprechende Antitumoraktivität bei soliden Tumoren oder Leukämie42,43. Allerdings haben weniger epigenetische Inhibitoren in klinischen Studien bei anderen Krankheiten als Krebs, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wirksame Reaktionen gezeigt. Unsere In-vitro-Ergebnisse bestätigten die Wirksamkeit des KDM5B-Inhibitors bei der Unterdrückung fibroblastenvermittelter profibrotischer Reaktionen. Zusammen mit den In-vivo-Daten, die die Abschwächung der durch KDM5B-Mangel vermittelten Herzfibrose zeigen, eröffnet unsere Studie neue Wege für die Entwicklung einer auf KDM5B ausgerichteten epigenetischen Therapie zur Überwindung pathologischer Herzfibrose.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Histon-Demethylase KDM5B die ATF3-Expression unterdrückt, indem sie H3K4me2/3 auf ihrem Promotor demethyliert, was anschließend eine übermäßige Expression profibrotischer Gene fördert und die Angiogenese hemmt. KDM5B treibt das Fortschreiten der Herzfibrose voran und erleichtert den nachteiligen Umbau des Herzens als Reaktion auf ischämischen oder hypertrophen Stress, was bei der Entwicklung neuartiger epigenetischer Therapien für pathologische Herzfibrose und Herzinsuffizienz hilfreich sein wird.

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Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2019YFA0801502), der National Natural Science Foundation of China (82070415, 82071790, 82101842) und dem Shuguang-Programm unterstützt, das von der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission (19SG17, 18SG33).

Schlüssellabor für Arrhythmien des chinesischen Bildungsministeriums, Forschungszentrum für translationale Medizin, Shanghai East Hospital, Medizinische Fakultät der Tongji-Universität, 200120, Shanghai, China

Bo Wang, Yong Tan, Sheng Zhang, Xuewen Duan, Tong Li und Zhenzhen Zhan

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Qingqing Zhou & Zhenzhen Zhan

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Zhenzhen Zhan

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BW, YT, YZ, SZ, XD, YJ, TL und QZ führten die Experimente durch, analysierten die Daten und interpretierten die Ergebnisse. BW verfasste das Manuskript und führte die statistischen Analysen durch. ZZ und XL konzipierten die Idee, konzipierten die Experimente, analysierten die Daten, überarbeiteten das Manuskript und stellten die Finanzierung für diese Studie bereit. Alle Autoren überarbeiteten das Manuskript kritisch hinsichtlich wichtiger intellektueller Inhalte.

Korrespondenz mit Xingguang Liu oder Zhenzhen Zhan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, B., Tan, Y., Zhang, Y. et al. Der Verlust von KDM5B lindert pathologische Herzfibrose und Funktionsstörungen durch epigenetische Steigerung der ATF3-Expression. Exp Mol Med 54, 2175–2187 (2022). https://doi.org/10.1038/s12276-022-00904-y

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Eingegangen: 19. April 2022

Überarbeitet: 26. September 2022

Angenommen: 24. Oktober 2022

Veröffentlicht: 08. Dezember 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-022-00904-y

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Der Verlust von KDM5B lindert pathologische Herzfibrose und Funktionsstörungen durch epigenetische Steigerung der ATF3-Expression